一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) DNA 含量的變化，檢測(cè)外界干預(yù)手段對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響。
二、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)胞周期（cell cycle）：是指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過(guò)程，通常由 G0/G1 期、S 期、G2/M 期組成。G0/G1 期：二倍體細(xì)胞的 DNA 含量 (2N)。S 期：DNA 開(kāi)始合成，這時(shí)細(xì)胞核內(nèi) DNA 的含量介于 G1 期和 G2 期之間。G2/M 期：DNA 復(fù)制結(jié)束成為 4 倍體（4N)。
碘化丙啶 (Propidium, PI)PI 為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸 DNA 或 RNA 雙鏈螺旋的堿基之間，產(chǎn)生紅色熒光，并且熒光強(qiáng)度和所嵌入的核酸含量成正比。細(xì)胞周期檢測(cè)時(shí)，首先用 RNA 酶將 RNA 消化排除影響，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) PI 熒光強(qiáng)度直接反映細(xì)胞各時(shí)相的 DNA 分布狀態(tài)，從而計(jì)算出各時(shí)相的百分率。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：待各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞融合度達(dá)到 70%，用胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來(lái)時(shí)，加入含有血清的完quan培養(yǎng)基終止消化，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000 g 左右離心 3 分鐘，沉淀細(xì)胞。小心吸除上清。加入 1 毫升冰浴預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到 1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。
對(duì)于懸浮細(xì)胞：收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，1000 g 左右離心 3 分鐘，沉淀細(xì)胞。小心吸除上清，加入 1 毫升冰浴預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到 1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。
2. 細(xì)胞固定：加入 1 毫升冰浴預(yù)冷 70% 乙醇，輕輕吹打混勻，4℃ 固定過(guò)夜。1000 g 左右離心 3 分鐘，沉淀細(xì)胞。小心吸除上清，加入 1 毫升冰浴預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。
3. 碘化丙啶染色液的配制：參考下表，根據(jù)待檢測(cè)樣品的數(shù)量配制適量的碘化丙啶染色液，現(xiàn)配現(xiàn)用：
| 1個(gè)樣品 | 6個(gè)樣品 | 12個(gè)樣品 | |
| RNase A (50X) | 10ul | 60ul | 120ul |
| 碘化丙啶染色液(25X) | 20ul | 120ul | 240ul |
| 染色緩沖液 | 470ul | 2.82ml | 5.64ml |
| Final volume | 500ul | 3.0ml | 6ml |
染色：每管細(xì)胞樣品中加入 0.5 毫升碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀， 37℃ 避光溫浴 30 分鐘。
流式檢測(cè)和分析：用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng) 488nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。采用分析軟件進(jìn)行細(xì)胞 DNA 含量分析和光散射分析。
四、常見(jiàn)問(wèn)題及解答
Q1：是否可以直接用乙醇固定細(xì)胞?
A：不可以，直接 70～75% 乙醇加入很容易導(dǎo)致細(xì)胞聚團(tuán)現(xiàn)象，很難重懸成單細(xì)胞，影響固定效果，其至容易導(dǎo)致固定后無(wú)細(xì)胞沉淀的現(xiàn)象。正確做法是: 待細(xì)胞, 充分分散成單細(xì)胞后，緩慢地滴入無(wú)水乙醇中，使其終濃度為 70～75%7 醇。
Q2：細(xì)胞量過(guò)少，無(wú)法獲得數(shù)據(jù)結(jié)果?
A：首先，要保證收集足夠的細(xì)胞樣品 (個(gè)人經(jīng)驗(yàn)至少收集 100 萬(wàn)左右): 如果藥物處理后。細(xì)胞死亡過(guò)多，應(yīng)該降低藥物濃度；其次，固定細(xì)胞時(shí)先用預(yù)冷的 PBS 重懸細(xì)胞，再逐滴滴入無(wú)水乙醇中；細(xì)胞清洗時(shí)，不可過(guò)度吹打細(xì)胞，以防產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)胞碎片。最后，盡量采用尖底的離心管和水平的離心機(jī)，離心后盡量用移液槍吸走上清，不要傾倒，殘留一點(diǎn)，不要吸完。
Q3：什么樣的數(shù)據(jù)結(jié)果可以用?
A：G2/M 期細(xì)胞的 DNA 含量是 G1 期的 2 倍，在直方圖上形成一個(gè) 2 倍于 G1 信號(hào)峰的高斯峰；CV(變異系數(shù)) 表示峰的寬度，CV 值越小，峰形越好，最好是在 5% 左右，一般小于 10%
也被認(rèn)可。RCS 最好是在 1～3，高于 5 則不被認(rèn)可。RCS 高，說(shuō)明數(shù)據(jù)的分布和軟件所建立模型的預(yù)期值的差別比較大，可能由于處理細(xì)胞的時(shí)候 RNA 酶消化不好，或者是 PI 的濃度不佳造成的。
Q4：如何提高分辨率和精確度?
A：變異系數(shù) (Coefficient of Variation，CV 值) 反映 G0/G1 峰分辨率和精確度。而樣品 CV 值為樣品固有，與樣本制備過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)量有關(guān)。細(xì)胞碎片越少、細(xì)胞聚團(tuán)越少、RNA 酶消化越充分，可以減少樣本的 CV 值，提高 G0/G1 峰分辨率和精確度。
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